−単一細胞レベルの精度を実現したマイクロアレイ法の応用と発展−
＜本研究成果のポイント＞
○生殖細胞の誕生過程に必須なBlimp遺伝子が体細胞化を抑制
○生殖細胞の誕生にはBlimp遺伝子とは独立したメカニズムも存在
○人体を構成する、あらゆる細胞系譜を規定する遺伝子群の解明へ寄与
独立行政法人 理化学研究所（野依 良治 理事長）は、生殖細胞の誕生機構に関与する全遺伝子群を同定し、その過程に必須とされる遺伝子「Blimp1」が生殖細胞の体細胞化を抑えるという重要な役割を果たしていることを明らかにしました。ほ乳類の代表的モデル生物であるマウスを使って、単一細胞レベルというこれまでにない精度で、生殖細胞の誕生機構を解明することを実現しました。理研 発生・再生科学総合研究センター（竹市 雅俊 センター長）哺乳類生殖細胞研究チーム（斎藤 通紀 チームリーダー）の栗本 一基 基礎科学特別研究員らによる成果です。
私たち人類を含む多細胞生物を構成する細胞群の中で、生殖細胞は、新しい個体を形成し、次世代に遺伝情報を継承しうる唯一の細胞系譜注１）です。そのため、その能力を支える分子機構の解明は、生命科学において最も本質的で重要な課題の１つであり、生殖医学、生殖工学、再生医学の発展に寄与する基盤情報を提供すると期待されています。
研究チームは、これまでに開発した「単一細胞マイクロアレイ法」を用い、マウスの発生過程で、生殖細胞の起源となる細胞である始原生殖細胞（精子及び卵子の源となる細胞）が、その前駆細胞から形成される際に発現する全遺伝子群を、系時的に捉えることに成功しました。さらに、この過程に必須な役割を果たすことが知られているBlimp1遺伝子（同チームを中心とする共同研究グループが２００５年に同定）を欠損した胚注２）を使って同様の解析を行い、Blimp1の詳細な作用機序を解明しました。今回同定した多くの新規遺伝子の機能解析から、生殖細胞形成過程を詳細に理解できるのはもちろんのこと、試験管内での生殖細胞系列の誘導を含む、新たな生殖工学・生殖医学の発展に大きな貢献をすることが期待できます。さらに、本研究は、単一細胞マイクロアレイ法を用いて、生体内の特定の細胞系譜を精密に解析した世界で初めての研究成果となりました。
この成果が先鞭となり、今後、発生過程および成体に存在するさまざまな組織の形成・機能維持過程に関与する全遺伝子群の同定が、次々に完了することが予想されます。こうした研究から得られる情報は、ES細胞もしくは組織幹細胞を起点とする再生医学の発展に、重要な基盤情報を提供するものとなります。
1．背景
ヒトを含む多細胞生物の一生の中で、今のところ絶対に避けては通れない現象が「死」です。この個体レベルでは不可避な現象を、種のレベルで回避するために用意されたユニークな細胞が、卵子や精子に代表される生殖細胞です。こうした「種の保存」という生物学的要請を満たすために、生殖細胞には、（１）細胞レベルにて必ず起こる老化現象を能動的にくい止め、幾世代にもわたり受け継がれてきた遺伝情報を理想的には完全な状態で維持する、（２）究極に分化した生殖細胞である卵子と精子が融合した際に、個体を形作る発生プログラムが滞りなく進むように、生殖細胞自身の遺伝情報をプログラムする、という２つの基本的な仕組みが埋め込まれています。そのため、この２つの仕組みを解明し、論理的に再構成することは、生物学の大きな目標の１つです。この過程は、さまざまな基盤現象（運命決定、ゲノム再編、増殖、性決定、減数分裂、成熟）を伴う非常に複雑なもので、全過程の分子基盤を正確に理解し、再現するためには、それぞれの過程について緻密な研究が必要となります。
理研 哺乳類生殖細胞研究チームは、代表的なモデル生物であるマウスの発生過程で、生殖細胞と体細胞が分離する機構、それにより生殖細胞が獲得する特性の理解を研究の出発点とし、生殖細胞だけに託されたゲノム情報再編・継承、全能性維持・再獲得の機構を理解し、再構成することを目指した研究を行ってきました。今回の成果は、その一連の研究の中で得られたものです。
2．研究手法
マウスの始原生殖細胞（生殖細胞の起源となる細胞で、精子または卵子の源となる）は、胚（胎児）がまだ数百個から数千個の細胞でできている時期に、数個から４０個程度形成されます。この時期の始原生殖細胞で、どの遺伝子が発現注３）しているのかを知るためには、細胞１つ１つを分離して、細胞ごとに調べることが最も効果的です。そこで、マウスの胚（受精後６．２５〜８．５日）から、始原生殖細胞が存在する大まかな部分をガラスナイフで切り出し、タンパク質分解酵素を用いて細胞同士の接着を分解し、細胞１つ１つに分離しました。分離した個々の細胞をランダムに採取し、研究チームが開発した「単一細胞cDNA増幅法注４）」によって、少量のmRNAからcDNAライブラリ注５）を作って、PCR注６）で増幅しました。どの細胞が、どんな遺伝子を発現するかは見た目ではわかりませんが、増幅したcDNAライブラリを調べることによって、細胞の性質を遺伝子発現のレベルで知ることができます。
マイクロアレイ注７）は、ゲノム上のどの遺伝子が発現しているのかを同時に複数調べることができ、全世界の研究施設で用いられているすぐれた解析技術です。その一方で、非常に多数の細胞（通常、数千個から数十万個）を必要とするという短所を併せ持ちます。培養細胞系など、同じような細胞からなる細胞集団であれば問題ありませんが、少数の、多様な細胞が複雑な構造を形成し機能している、生体内の組織や器官（特に発生過程の各組織、幹細胞生物、神経、さらには病態を示した組織）では、従来のマイクロアレイ解析では１つ１つの細胞を区別できないため、直接的な応用には限界がありました。研究チームの開発した単一細胞cDNA増幅法を生かした「単一細胞マイクロアレイ法」は、この限界を克服し、１つ１つの細胞を別々に解析することを可能にすることで、ゲノムレベルでの遺伝子発現解析の適用範囲を飛躍的に拡大することに成功しました。
研究チームは、２００５年に始原生殖細胞の形成に必要な遺伝子「Blimp1」を発見しました（Ohinata et al., Nature 436: 207-13, 2005）。このBlimp1遺伝子を遺伝的マーカー注８）にして、ランダムに採取した細胞から調製したcDNAライブラリから、始原生殖細胞のcDNAライブラリを同定しました。このようにして生殖細胞を選び、マイクロアレイを用いて、発現する全遺伝子注９）の発現量を解析しました。具体的には、受精後６．２５〜８．５日の胚から６点の時系列（図１）の、始原生殖細胞の単一細胞マイクロアレイデータを得ました。また、Blimp1欠損胚についても同様の解析を行い、始原生殖細胞形成過程のどこにBlimp1遺伝子が必要であるのかを調べました。
3．研究成果
解析の結果、始原生殖細胞が形成される過程で発現する遺伝子群の全容と、その動態が明らかとなりました（図２）。始原生殖細胞の時系列データは複雑ですが、秩序だった遺伝子発現動態を示していました。生殖細胞は、遺伝情報を次世代に伝えるという極めて特殊な役割を持つため、体細胞と明らかに異なる性質を持ちます。しかし、その初期には、胚発生の進行に伴って周囲の体細胞と同様の性質（遺伝子発現パターン）を示すようになること、そしてBlimp1遺伝子を発現した細胞だけが、その後、体細胞化を抑え生殖細胞としての性質を獲得できることを見いだしました。一方、Blimp1欠損胚では、本来生殖細胞になるべき細胞でも、開始した体細胞化がまったく抑制されなくなることがわかりました。しかし、Blimp1欠損胚でも、始原生殖細胞で発現すべき遺伝子のおよそ半分が、不完全ながら発現を開始していました。これらの結果から、Blimp1遺伝子は体細胞化の抑制に支配的な役割を果たしており、また同時に、Blimp1遺伝子の制御とは独立して開始する、生殖細胞形成メカニズムの存在が示唆されました。
4．今後の期待
今回の研究により、始原生殖細胞が形成される過程で発現する遺伝子群の全容とその動態が明らかとなりました。また、その過程で重要な役割を果たすBlimp1の作用機序を解明しました。これらの成果は、生体に存在する特定の細胞系譜の決定に関与する全遺伝子群の発現動態と、その過程に関与する重要な遺伝子機能を、単一細胞レベルの精度で明らかにした世界で初めての研究成果となります。今後、以下に記すような発展が期待できます。
（1） 同定した新規遺伝子群の生殖細胞形成過程における機能解析や利用
本研究により、生殖細胞形成過程に関与する遺伝子群の全容が明らかとなりました。これらの中には、機能がいまだに知られていない新規遺伝子群も多数含まれており、それらの機能解析により、生殖細胞形成過程の分子機構をさらに詳細に理解できるようになります。また、生殖細胞で特異的に発現する遺伝子群は、生殖細胞に特異的な遺伝子操作（遺伝子破壊や過剰発現）を行う際の、有用なツールとなり得ると期待できます。
（2） 試験管内での生殖細胞系列誘導系の確立と評価
これまで世界のさまざまな研究者が、ES細胞から生殖系列の細胞を誘導する研究を行ってきました。これらの研究により、生殖細胞の形成過程の科学的な理解が促進することに加え、究極的には、誘導した生殖細胞を、不妊治療を含む生殖補助医療に用いることが期待されます。しかし、いまだ実験レベルでも機能的な（子孫を形成しうる）生殖細胞の作成に成功した例はありません注１０）。これは、 生殖細胞の発生過程が十分に理解されていなかったため、理論的にES 細胞を起点とする生殖細胞の誘導が不可能であったこと、 誘導された細胞がどの程度正しいものであるかを判断する基準が乏しかったこと、によると考えられます。今回の研究で得た情報は、試験管内で誘導される生殖細胞様細胞が、どの程度正しく形成されているかを判定する貴重な情報になるだけでなく、今後、生殖細胞系列を誘導する系を開発するために、基盤となる情報を提供するものです。
（3） ほかの細胞系譜の解析への発展と組織再生医学の基盤情報形成
本研究成果を得るために重要な役割を果たした単一細胞マイクロアレイ法は、基本的には、発生過程および成体に存在するあらゆる細胞系譜の形成・機能維持過程の解明に応用が可能です。すなわち、この方法論の開発により、さまざまな生物学・医学生理学的文脈における、いかなる時点の、いかなる細胞からも、ゲノムワイドな遺伝子発現プロファイルを取得できる基盤を形成したことになります。少数の特異的細胞群が、しばしば決定的な役割を果たす発生生物学、幹細胞生物学、神経生物学分野、さらには少量の材料から診断が必要な医学分野などでは、少数の、理想的には単一の細胞機能を解析する需要が増大しています。それら多くの生命科学分野において、今後単一細胞マイクロアレイ法は決定的な役割を果たすことが期待できます。
全国２１の不妊治療クリニックで作る「日本生殖補助医療標準化機関（ＪＩＳＡＲＴ）」は７日、友人や姉妹から提供された卵子を使う非配偶者間の体外受精を２例実施し、妊娠に成功したことを明らかにした。
いずれも年内に出産予定。卵子提供による体外受精について国のルール作りが進まない中、民間のクリニックによる既成事実化がまたも進むことになる。
この日開かれた同機関の理事会では、卵子提供による体外受精の独自指針も承認された。
この２例は、いずれも妻が比較的若い年齢で排卵が止まる病気のため、卵子提供を受けないと妊娠できない夫婦。１組は友人から、もう１組は姉妹から卵子の提供を受け、３月〜４月上旬に夫の精子と体外受精、１回で妊娠した。実施したのは西日本の２施設。
同機関の理事会は昨年６月、この２例の実施を承認したが、日本産科婦人科学会の要請で、生殖補助医療のルールを検討していた日本学術会議の結論が出るまで、実施を先送りしていた。
だが、同会議は卵子提供について見解を示さず、同機関は今年３月、「患者を待たせられない」として実施を決めていた。
無精子症など男性側に不妊原因がある夫婦に、第三者が精子を提供する非配偶者間人工授精（ＡＩＤ）。日本では精子提供者（ドナー）は匿名が前提だった。いま、子供の「出自を知る権利」の観点からドナーの開示を求める声が高まり、医療現場が揺れている。
◆議論は不十分
精子提供者の身元は、提供を受ける夫婦にも生まれてくる子供にも一切明かされない。１９４８年に日本で初めて実施した慶応大病院（東京）で、現在診療に当たる久慈直昭医師が説明する。
「提供から何年もたって突然『あなたの精子で生まれた』と子供が会いに来たらどうなるか。それが原因で一つの家庭が壊れることもあるかもしれない。ＡＩＤを続けるには、ドナーの将来を守らなければならない」
ドナーのなり手はＡＩＤ実施施設とつながりがある大学の学生やＯＢが中心。多くの施設では、アルバイト代や食事代などの名目で提供１回につき１万５０００〜３万円が支払われていた。
ほかにも「薬や検査などで取引がある会社の社員に頼む」「自施設でほかの不妊治療を受け子供ができた夫婦に依頼、妻の同意を得て夫に提供してもらう。自分たちが苦労したので協力したいと言ってくれる」などがあった。
中には、夫の父親や兄弟の精子による人工授精を希望する夫婦も。ドナーを匿名とする日本産科婦人科学会の会告（指針）には抵触する可能性があるが「頼まれれば目をつぶってすることもある」と話す関係者もいる。
◆ＡＩＤ取りやめも
ＡＩＤは他の治療では子供をつくる望みがない夫婦の「最後の選択肢」とされ、第三者の協力が必要な点は、子宮がない女性が別の女性に子供を産んでもらう代理出産と同じ。ただ、精子提供には身体的負担がなく、国民的議論が不十分なまま「既成事実」として受け入れられてきた。
しかし２００３年ごろから、ＡＩＤで生まれた人たちが「遺伝上の父親を知りたい」と声を上げ始めた。医師の受け止め方はさまざまだ。
「ドナー開示の法律ができたらＡＩＤはやめる。提供がなくなり事実上できなくなる」「自分の出自として知りたいという人がいる以上、ドアは開けておくべきだ」
ある関係者は「出自を知る権利の大切さはよく分かる。今まで悩みながら続けてきたが、身元を開示してよいというドナーが現れるまで実施しないことにした」とＡＩＤからの撤退を明かした。
久慈医師は言う。
「提供者を知りたいと思うのは自然で、いつまでも『駄目』と言うのは通らない。情報をどの程度開示し、どんな制限をつけるのか。みんなが納得できる仕組みを考える必要がある」
子供にどう伝えるかも難しい問題だ。血がつながらない夫への配慮や、子供にショックを与えたくないとの理由から秘密にするケースが多いのが現状。だが両親の離婚や病気など、悲しい出来事をきっかけに事実を知らされた人たちは、それまで隠されていたことに二重に傷ついたという。
昨年１２月、ＡＩＤで生まれた当事者の会が東京都内で開いた講演会で、４０代の女性はこう訴えた。
「親子の間にうそがないことが大切。小さいうちから子供をぎゅっと抱き締めて『お父さんと血はつながっていないけど、私たちはおまえを愛している、ずっと親子だよ』と話してあげて」
男性側に不妊原因がある夫婦のため、第三者の男性ボランティアが提供した精子を使う「非配偶者間人工授精（ＡＩＤ）」の実施施設数が全国で１４となり、５年前と比べほぼ半減したことが２４日、共同通信の調査で分かった。日本ではＡＩＤ初実施から今年で６０年。全国で１万人以上が生まれたとされる。精子提供者（ドナー）を匿名とする方法が「子供の福祉」と矛盾するとしてドナー開示論議が高まる中、精子の確保が難しい実情が背景にある。
３〜５月に調査。日本産科婦人科学会にＡＩＤ施設と登録している病院や不妊クリニックは、１５年時点の２６が１６に減。さらに２施設が撤退を明らかにした。
ＡＩＤで生まれた事実の告知は、「あえて子供に不安や迷いを持たせる必要はない」「知らずにいた方が子供は幸せ」との意見の一方、「家族間にうそがなくなる」との意見もあった。
2008年5月22日、家庭保健報は、中国で社会や家庭を支える中心となる男性の健康問題に関して、現代社会の競争が熾烈化しストレスが増え続ける中、明かに疲労感を募らせ、健康状態が著しく悪化していると報じた。
顕著に見られる特徴として以下の3つを挙げている。
1、男性更年期障害発生の早期化。最近の各種データによると、老化が始まる年齢は1980年代末より大幅に早まっており、更年期障害はこれまでは60歳以降に見られ始めたが、現在は40歳前後から症状が見られるという。
2、男性特有疾患の発生率上昇。前立腺疾患、性機能障害、泌尿生殖感染、不妊症の発病率が上昇しており、最大の脅威となっているのが前立腺疾患で、青壮年での発生率が高いという。前立腺が炎症すると慢性腎炎や前立腺増殖症、不妊症を起こし、さらに精嚢炎、睾丸炎、膀胱炎などを併発させる。もう1つ脅威は泌尿生殖感染で、早期治療を怠れば感染を繰り返し、最後は不妊症に。このほか、電磁波や放射線、新素材による環境汚染も男性の生殖機能を低下させる要因となっているという。
3、精神的なストレスが大きい。特に中年層は外では仕事上の責任、家では老人の面倒と子女の養育・教育に対する責任が重くのしかかり、ストレスから内分泌失調を起こすという。さらには喫煙や飲酒の習慣から生殖器疾患が発病する。